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青島能源所研發出高耐久低成本的DNA合成糾錯系統
2020-03-12 | 編輯: | 【 】| | 供稿部門:單細胞中心
    

  DNA的從頭合成是合成生物技術的基礎平臺之一。但是,由于大規模DNA合成過程中難以避免地產生錯誤,DNA糾錯環節的效率和經濟性已經成為限制DNA合成質量、通量與成本的關鍵問題之一。針對此瓶頸,青島能源所單細胞中心研發出高耐久低成本的DNA合成糾錯系統,大幅度提高了DNA糾錯環節的效率和經濟性。該工作發表于ACS Synthetic Biology。

  就像我們寫字一樣,DNA合成是一個容易出錯的過程。寡核苷酸的化學合成、DNA聚合酶的延伸、基于寡核苷酸的基因片段組裝等大片段DNA合成的每一步驟均可能引入錯誤堿基。這些“錯誤”如果沒有及時“糾正”,它們將隨著核酸鏈的復制而傳播和擴散,導致DNA合成產物中一般只有5%-60%具有完全正確的序列。因此,DNA糾錯環節的效率和經濟性已經成為限制DNA合成質量、通量與成本的關鍵問題之一。

  與其它的酶糾錯系統相比,DNA錯配修復蛋白(MutS)的糾錯效率較高,而且使用相對簡便。但在實際應用中,MutS酶活的持久性較差,在7天左右即開始顯著下降,導致在一個完整的基因組合成流程中需要多次表達與純化。這不僅阻礙了糾錯環節的通量化和規模化,也限制了MutS糾錯系統的工業化應用。

  針對這一瓶頸問題,單細胞中心張佳博士帶領的攻關小組,首先,提出了基于搭建人工二硫鍵來提高酶活持久性的思路,根據MutS的X射線晶體結構,理性設計了10組可能顯著提高蛋白質穩定性的二硫鍵,并從實驗中篩選出最佳的組合。其次,通過與麥芽糖結合蛋白 (MBP)的融合表達,來提高MutS蛋白的異源表達量。最后,通過儲存條件的優化,將MutS蛋白與纖維素結合掛柱并保存在四攝氏度,進一步提高了MutS的使用壽命。最終構建的名為iMICC的DNA合成糾錯系統,在保證糾錯性能的前提下,能夠保持峰值酶活長達63天,因此不再需要頻繁地重復制備新鮮的MutS。同時,成品掛柱的儲存方式還大大提高了使用的便捷性。

  針對在溶液中合成Cas9同源基因和在芯片上合成木糖還原酶同源基因等的驗證表明,iMICC能夠將基因合成產物的錯誤率分別降低到0.64 / Kb和0.41 / Kb,組裝成的正確片段占比72.1%和86.4%,而成本僅為$0.37/反應。因此,iMICC能夠將基因合成過程中的堿基準確性提高37.6倍,同時大幅度提高了使用壽命。與常用的商品化糾錯酶CorrectASE相比,iMICC的糾錯性能高出6.6倍,卻便宜了26.7倍。 

  因此,iMICC為建立一個更為簡便、高效、穩定和低成本的工業化糾錯流程奠定了基礎。此外,這也是首次證明了二硫鍵的理性設計與搭建可以提高酶活的持久性,該思路為包括DNA糾錯酶在內的諸多核酸工具酶的提質改性提供了有益啟發。

  單細胞中心張佳博士是該論文的第一作者。該工作由單細胞中心徐健研究員主持完成,得到了研究所姚禮山研究員團隊、趙廣研究員團隊和聯川生物技術公司高曉連教授、李璐璐博士等的幫助。該研究獲得了國家自然科學青年基金、杰青等項目的支持。(文/圖 張佳)

  論文

  Zhang, J., Wang, Y. F., Chai, B. H., Wang, J. C., Li, L. L., Liu, M., Zhao, G., Yao, L. S., Gao, X. L., Yin, Y. F., and Xu, J*. (2020). Efficient and low-cost error removal in DNA synthesis by a high-durability MutS. ACS Synthetic Biology.

    文章鏈接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00079

   

 
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